Δοκιμασίες ενεργοποίησης
Η επεξεργασία του σπέρματος με σκοπό την ενεργοποίηση των σπερματοζωαρίων in vitro πραγματοποιείται συνήθως με δύο τρόπους: την ισοπυκνική φυγοκέντρηση σε κλίση πυκνότητας κολλοειδών διαλυμάτων και τη μέθοδο swim-up.
Μέθοδος κλίσης πυκνότητας (Density Gradient)
Κατά τη φυσιολογική σύλληψη, τα σπερματοζωάρια διαχωρίζονται από το σπερματικό πλάσμα και αποκτούν συγκεκριμένα χαρακτηριστικά κατά τη διέλευσή τους από τον τράχηλο της μήτρας. Στο εργαστήριο, μια ειδική επεξεργασία επιτρέπει να μιμηθούμε αυτό το φυσιολογικό στάδιο.
Η επεξεργασία συνίσταται σε μια σειρά φυγοκεντρήσεων, κατά τις οποίες τα σπερματοζωάρια υποχρεώνονται να διασχίσουν πολλαπλές στοιβάδες κολλοειδούς διαλύματος αύξουσας πυκνότητας, σε ειδικά σωληνάρια. Ονομάζεται Density Gradient, αν και το συγκεκριμένο κολλοειδές (Density Gradient) χρησιμοποιείται μόνον για διαγνωστικούς σκοπούς (στην κλινική εφαρμογή χρησιμοποιούνται παρόμοια προϊόντα, εγκεκριμένα για κλινική χρήση, όπως π.χ. το pure sperm).
Το σπερματικό πλάσμα, τα λευκά αιμοσφαίρια, καθώς και τα περισσότερα είδη βακτηρίων και μυκήτων κατακρατώνται στις ενδιάμεσες στοιβάδες του κολλοειδούς μαζί με τα ακίνητα σπερματοζωάρια. Τα κινητά σπερματοζωάρια καταλήγουν στον πυθμένα του σωληναρίου και έτσι απομονώνονται. Αφού αφαιρεθούν όλες οι άλλες στοιβάδες, ακολουθούν εκπλύσεις των κεκαθαρμένων σπερματοζωαρίων, ώστε να απομακρυνθεί το κολλοειδές. Η διαδικασία διαρκεί περίπου 60 λεπτά και εφαρμόζεται διαγνωστικά, ή απαραιτήτως πριν την ενδομήτρια σπερματέγχυση ή την εξωσωματική γονιμοποίηση.
Ο αριθμός και η κινητικότητα των σπερματοζωαρίων προσδιορίζονται πριν και μετά την ενεργοποίηση. Κατά κανόνα ο αριθμός μειώνεται, αλλά η κινητικότητα και το ποσοστό μορφολογικώς φυσιολογικών σπερματοζωαρίων βελτιώνονται με την επεξεργασία αυτή. Τα αποτελέσματα αυτής της δοκιμασίας καθορίζουν και τη θεραπευτική στρατηγική που θα προταθεί (σπερματέγχυση, εξωσωματική γονιμοποίηση, μικρογονιμοποίηση).
Σε πολύ ειδικές περιπτώσεις, τα σπερματοζωάρια δεν αντέχουν στην επεξεργασία αυτή, η οποία είναι εξαιρετικά επιλεκτική. Τότε, εφαρμόζονται άλλες μέθοδοι για τον διαχωρισμό και την ενεργοποίησή τους, όπως η μέθοδος swim-up. Η μέθοδος αυτή είναι λιγότερο επιλεκτική, αλλά και λιγότερο ασφαλής, πρέπει επομένως να εφαρμόζεται μόνον όταν δεν υπάρχει άλλος τρόπος επεξεργασίας.
Μέθοδος swim up
Το δείγμα σπέρματος αραιώνεται με καλλιεργητικό υλικό και φυγοκεντρείται (5 λεπτά, 200Xg). Το υπερκείμενο απομακρύνεται, το δε ίζημα με τα σπερματοζωάρια και άλλα κύτταρα αραιώνεται σε μικρό όγκο καλλιεργητικού μέσου, επικαλύπτεται με περίπου 1 ml επί πλέον μέσου και τοποθετείται σε επωαστικό κλίβανο. Τα σπερματοζωάρια «κολυμπούν» μέσα στο υπερκείμενο καλλιεργητικό μέσον, εξ ου και η ονομασία της μεθόδου («κολύμπι προς τα άνω»). Μόνο τα κινητά και ταχέως κινούμενα σπερματοζωάρια μεταναστεύουν στο υπερκείμενο.
Μετά περίπου 1 ώρα αναρροφάται προσεκτικά το υπερκείμενο υγρό, το οποίο περιέχει τα γρήγορα σπερματοζωάρια. Η μέθοδος σήμερα χρησιμοποιείται σπανίως και δεν συνιστάται αν η κινητικότητα είναι χαμηλή και το σπέρμα περιέχει πολλά λευκοκύτταρα.
